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CBD et analogues synthétiques : effet sur récepteurs vanilloïdes VR1

CBD et analogues synthétiques : effet sur récepteurs vanilloïdes VR1

Source de l'étude publiée le 3 août 2001 :
Cibles moléculaires pour le cannabidiol et ses analogues synthétiques: effet sur les récepteurs vanilloïdes VR1 et sur l’absorption cellulaire et l’hydrolyse enzymatique de l’anandamide - Bisogno - 2001 - British Journal of Pharmacology - Wiley Online Library

Tiziana Bisogno, Lumír Hanuš, Luciano De Petrocellis, Susanna Tchilibon, Datta E Ponde, Inès Brandi, Aniello Schiano Moriello, John B. Davis, Raphaël Mechoulam, Vincenzo Di Marzo
  • 2001, Molecular targets for cannabidiol and its synthetic analogues: effect on vanilloid VR1 receptors and on the cellular uptake and enzymatic hydrolysis of anandamide.
  • British Journal of Pharmacology, 134: 845-852.
DOI: https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0704327

Présentation résumée de l'étude

  • Le (−)-Cannabidiol (CBD) est un composant non psychotrope du cannabis avec une utilisation thérapeutique possible en tant que médicament anti-inflammatoire. On sait peu de choses sur les cibles moléculaires possibles de ce composé. Nous avons cherché à savoir si le CBD et certains de ses dérivés interagissent avec le récepteur vanilloïde de type 1 (VR1), le récepteur de la capsaïcine, ou avec des protéines qui inactivent le cannabinoïde endogène, l’anandamide (AEA).

  • Le CBD et son énantiomère, le (+)-CBD, ainsi que sept analogues, obtenus en échangeant le groupe méthyle C-7 du CBD avec une fonction hydroxy-méthyle ou carboxyle et/ou le groupe pentyle C-5′ avec un groupe di-méthyl-heptyle (DMH), ont été testés sur : (a) Augmentation médiée par VR1 du Ca cytosolique2+ concentrations dans les cellules surexprimant VR1 humain; b) [14absorption de C]-AEA par les cellules RBL-2H3, facilitée par un transporteur sélectif de membrane; et c) [14Hydrolyse C]-AEA par les membranes cérébrales du rat, qui est catalysée par l’hydrolase d’amide d’acide gras.

  • Le CBD et le (+)-CBD, mais pas les autres analogues, ont stimulé la VR1 avec la CE50= 3,2 – 3,5 μ M, et avec un effet maximal similaire en efficacité à celui de la capsaïcine, soit 67 – 70% de l’effet obtenu avec l’ionomycine (4 μM). Le CBD (10 μM) a désensibilisé VR1 à l’action de la capsaïcine. Les effets des doses maximales des deux composés n’étaient pas additifs.

  • (+)-5′-DMH-CBD et (+)-7-hydroxy-5′-DMH-CBD inhibés [14Absorption par C]-AEA (IC50= 10,0 et 7,0 μM); les énantiomères (−) étaient légèrement moins actifs (IC50= 14,0 et 12,5 μM). Le CBD et le (+)-CBD étaient également actifs (IC50= 22,0 et 17,0 μM).

  • CBD (IC50=27,5 μM), (+)-CBD (IC50= 63,5 μM) et (−)-7-hydroxy-CBD (IC50= 34 μM), mais pas les autres analogues (IC50>100 μM), faiblement inhibée [14Hydrolyse C]-AEA.

  • Seuls les isomères (+) présentaient une forte affinité pour le CB1 et/ou CB2 récepteurs cannabinoïdes.

  • Ces résultats suggèrent que les récepteurs VR1, ou des niveaux accrus d’AEA endogène, pourraient atténuer certains des effets pharmacologiques du CBD et de ses analogues. Compte tenu de la synthèse facile à haut rendement et de la faible affinité pour le CB1 et CB2 , (−)-5′-DMH-CBD représente un candidat précieux pour une étude plus approfondie en tant qu’inhibiteur de l’absorption de l’AEA et un nouvel agent thérapeutique possible.

 

British Journal of Pharmacology (2001) 134, 845-852; doi:10.1038/sj.bjp.0704327

Abréviations:

AEA
arachidonoyléthanolamide
L’AMT
Transporteur membranaire d’anandamide
CDB
(−)-cannabidiol
[Ca2+]Je
concentration de calcium cytosolique
DMH
di-méthyl-heptyle
FAAH
hydrolase d’amide d’acides gras
HÉK
Rein hembryonnaire humain
HEK-hVR1
Cellules HEK transfectées avec l’ADNc VR1 humain
THC
(−)-Δ9-tétrahydrocannabinol
.SRT
Récepteur vanilloïde de type 1

Introduction

Parmi les constituants bioactifs du Cannabis sativa, le (−)-cannabidiol (CBD, Figure 1) est l’un de ceux qui ont le plus fort potentiel d’usage thérapeutique (Mechoulam, 1999). Bien que les propriétés pharmacologiques de l’autre composant majeur du cannabis, (−)-Δ9-tétrahydrocannabinol (THC), ont fait l’objet d’études plus approfondies (Mechoulam, 1999; Pertwee, 1999, pour les critiques), le THC, contrairement au CBD, présente de puissants effets psychotropes, qui ont compliqué l’évaluation complète de son potentiel thérapeutique. On sait peu de choses sur le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) d’action du CBD, qui, contrairement au THC, a très peu d’affinité pour les sous-types de récepteurs cannabinoïdes identifiés jusqu’à présent, le CB1 et CB2 (Pertwee, 1997, pour examen). Des études récentes, ainsi que la découverte antérieure de l’activité anti-anxiété (Guimaraes et al., 1994), neuroprotectrice et anti-convulsive du CBD et de certains de ses analogues (Consroe et al., 1981; Martin et coll., 1987), indiquent que le CBD peut également exercer des effets cytoprotecteurs en inhibant la libération de cytokines inflammatoires par les cellules sanguines (Srivastava et coll., 1998; Malfait et al., 2000), produisant ainsi une action anti-inflammatoire, par exemple contre la polyarthrite rhumatoïde (Malfait et al., 2000). Ces effets du CBD peuvent être dus à ses propriétés antioxydantes (Hampson et al., 1998), à son interaction directe avec les enzymes du cytochrome p450 (Bornheim & Correia, 1989) et d’autres enzymes de la « cascade arachidonate » (Burstein et al., 1985), ou à une action sur un récepteur spécifique. Des études récentes ont examiné si le CBD interagit avec les protéines du « système de signalisation endocannabinoïde » autres que le CB.1/CB2 Récepteurs. Ces protéines sont : (i) l’hydrolase des amides d’acides gras (FAAH) (Cravatt et coll., 1996), l’enzyme intracellulaire catalysant l’hydrolyse du ligand cannabinoïde endogène, l’anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) (Ueda et coll., 2000, pour examen); et ii) le « transporteur membranaire d’anandamide » (AMT) (Di Marzo et coll., 1994), qui facilite le transport de l’AEA à travers la membrane cellulaire et, par la suite, sa dégradation intracellulaire (Hillard et Jarrahian, 2000, pour examen). Il a été constaté que le CBD inhibe à la fois l’hydrolyse de l’AEA par des préparations membranaires contenant du FAAH (Watanabe et al., 1996) et l’absorption de l’AEA par les cellules RBL – 2H3 via l’AMT (Rakhshan et al., 2000). Bien que ces effets aient été observés à des concentrations élevées de μM, ces résultats ont soulevé la possibilité que certaines des actions pharmacologiques du CBD pourraient être dues à l’inhibition de la dégradation de l’AEA, avec une augmentation ultérieure des niveaux endogènes de ce médiateur, pour lesquels des propriétés neuroprotectrices (Hansen et al., 1998) et anti-inflammatoires (Di Marzo et al., 2000a) ont déjà été suggérées.

 Graphique 1

Ouvrir dans la visionneuse de figuresPowerPoint (en anglais)

Structures chimiques du cannabidiol et de la capsaïcine. La numérotation des atomes de carbone cannabidiol et une conformation possible de type cannabidiol pour la capsaïcine sont indiquées.

De nombreuses activités pharmacologiques du CBD n’ont été établies que in vivo, donc certaines d’entre elles peuvent être dues aux métabolites du CBD. Le métabolisme du CBD est bien établi. L’étape primaire est l’hydroxylation sur C-7, conduisant à (−)-7-hydroxy-CBD, suivie d’une oxydation supplémentaire en (-)-7-carboxy-CBD (Agurell et al., 1986). Bien que le métabolisme de l’homologue diméthyl-heptyle du CBD et de l’énantiomère (+) du CBD n’ait pas été étudié, il est raisonnable de supposer qu’il suit les mêmes voies. Par conséquent, nous avons préparé ces métabolites CBD, leurs homologues DMH et certains des métabolites respectifs de la série non naturelle (+). En particulier, dans la présente étude, nous avons examiné si la stéréochimie et la présence de certains groupes chimiques sur le C-5′ et le C-1 du CBD affectent sa capacité à influencer l’inactivation de l’AEA via l’AMT et la FAAH. De plus, nous avons abordé la question du transducteur moléculaire possible du CBD en étudiant la possibilité que ce composé naturel, son (+)-énantiomère et certains de ses analogues synthétiques, interagissent avec une autre cible proposée pour l’AEA, à savoir le récepteur vanilloïde de type 1 (VR1) pour la capsaïcine (Holzer, 1991, Figure 1). Cette protéine est un canal cationique non spécifique activé par ligand, chaleur et proton agissant comme intégrateur moléculaire de stimuli nociceptifs (Tominaga et coll., 1998). Récemment, on a découvert que l’AEA est un agoniste VR1 complet, quoique faible (Zygmunt et coll., 1999; Smart et coll., 2000) et que les analogues synthétiques de la capsaïcine peuvent interagir avec l’un ou l’autre des CB1 ou l’AMT, ou les deux (Di Marzo et coll., 1998). Ainsi, il semble y avoir un certain chevauchement entre les propriétés de reconnaissance des ligands de VR1 et CB1 et, en particulier, de VR1 et de l’AMT (de petrocellis et coll., 2000; Szallasi et Di Marzo, 2000). Bien que VR1, via la libération de peptides inflammatoires et algésiques, soit impliqué dans l’hyperalgésie inflammatoire (Davis et al., 2000; Caterina et coll., 2000), la stimulation de ce récepteur par la capsaïcine et certains de ses analogues entraîne une désensibilisation rapide, avec des effets analgésiques et anti-inflammatoires paradoxaux subséquents (Holzer, 1991; Szallasi et Blumberg, 1999). En conséquence de cet effet tachyphylactique, la capsaïcine, comme le CBD, a été utilisée pour traiter l’arthrite (Lorton et al., 2000) et les convulsions (Dib & Falchi, 1996).

Nous rapportons des données suggérant que VR1 est une cible moléculaire possible pour le CBD, et que les inhibiteurs de l’AMT peuvent être développés par modification chimique de ce produit naturel.

Méthode

Matériaux

La synthèse de certains des composés analysés dans cette étude sera décrite séparément. Le CBD, dont la structure et la stéréochimie ont été décrites il y a de nombreuses années (Mechoulam & Shvo, 1963; Mechoulam & Gaoni, 1967), a été isolé du haschisch. Le (−)-5′-DMH-CBD, le (+)-CBD et le (+)-5′-DMH-CBD ont été préparés comme décrit précédemment (Baek et coll., 1985; Leite et coll., 1982). La synthèse du métabolite du CBD, le (−)-7-hydroxy-CBD, a récemment été signalée (Tchilibon & Mechoulam, 2000). [14C]-AEA (5 mCi mmol)−1) a été synthétisé à partir de [14C]-éthanolamine et chlorure d’arachidonoyle décrits (Devane et coll., 1992b). La capsaïcine, l’ionomycine et la capsazépine ont été achetées auprès de Sigma.

Concentration de calcium cytosolique ([Ca)2+]Je)

La surexpression de l’ADNc VR1 humain dans les cellules rénales embryonnaires humaines (HEK) 293 a été réalisée comme décrit précédemment (Hayes et al., 2000). Les cellules ont été cultivées en monocouches dans un milieu essentiel minimum complété par des acides aminés non essentiels, 10% de sérum de veau fœtal et 0,2 mde glutamine, et maintenues sous 95% / 5% O2/CO2 à 37°C. L’effet des substances sur [Ca2+]Je a été déterminé à l’aide de Fluo-3, une sonde fluorescente intracellulaire sélective pour le Ca2+ (Smart et coll., 2000; de Petrocellis et coll., 2000). Un jour avant les expériences, les cellules ont été transférées dans des boîtes à 6 puits enrobées de Poly-L-lysine (Sigma) et cultivées dans le milieu de culture mentionné ci-dessus. Le jour de l’expérience, les cellules (50 à 60 000 par puits) ont été chargées pendant 2 h à 25 ° C avec 4 μM Fluo-3 méthylester (sondes moléculaires) dans du DMSO contenant 0,04% de pluoronique. Après le chargement, les cellules ont été lavées avec du Tyrode pH=7,4, trypsinisées, remises en suspension dans du Tyrode et transférées dans la cuvette du détecteur de fluorescence (Perkin-Elmer LS50B) sous agitation continue. Des expériences ont été réalisées en mesurant la fluorescence des cellules à 25 °C (λEX=488 nm, λEM= 540 nm) avant et après l’addition des composés d’essai à différentes concentrations. La capsazépine (10 μM) a été ajoutée 30 min avant le CBD. Les données sont exprimées sous la forme de la concentration exerçant un effet demi-maximal (EC50). L’efficacité de l’effet a été déterminée en le comparant à l’effet analogue observé avec l’ionomycine 4 μM. L’étalonnage de la réponse a été effectué en mesurant l’intensité de fluorescence du fluo-3 intracellulaire avec [Ca extracellulaire connu]2+] (Sondes moléculaires). L’équation suivante a été utilisée pour déterminer une constante de dissociation ionique (Kd) de 325 nM:
image
où FMin et F.max Les intensités de fluorescence de fluo-3 sont-elles sans ou avec un maximum de [Ca]2+], et F est l’intensité de fluorescence avec un intermédiaire [Ca2+]. Moyenne FEM/FEX était de 200 et cette valeur a été augmentée de 60±7% en présence de 4 μM ionomycine.

Tests de liaison aux récepteurs VR1

L’affinité du CBD et du (+)-CBD pour les récepteurs VR1 humains a été évaluée au moyen d’essais de déplacement réalisés avec des membranes (tube de 50 μg−1) à partir de cellules HEK-hVR1, préparées comme décrit précédemment (Ross et coll., 2001), et du ligand VR1 de haute affinité [3H]-résinifératoxine (48 Ci mmol)−1NEN-Dupont), en utilisant les conditions d’incubation décrites précédemment (Ross et coll., 2001). Dans ces conditions, le Kd et B.max pour [3H]-résinifératoxine étaient de 0,5 nM et 1,39 pmol mg−1 protéine. Le KJe pour le déplacement de 1 nM [3La H]-résinifératoxine en augmentant les concentrations de CBD et de (+)-CBD a été calculée à partir de l’IC50 (obtenues par GraphPad Software) à l’aide de l’équation de Cheng – Prusoff. La liaison spécifique a été calculée avec la résinifératoxine 1 μM (Alexis Biochemicals) et était de 78,1±3,7%.

Cannabinoïde CB1 et CB2 Essais de liaison aux récepteurs

Ces méthodes ont été décrites précédemment par Devane et al. (1992a) pour CB1, et Bayewitch et al. (1996) pour CB2. Pour CB1 Des tests de liaison aux récepteurs des membranes synaptosomiques provenant de cerveaux de rats ont été utilisés. Des rats mâles Sabra pesant entre 250 et 300 g ont été décapités et leur cerveau, sans le tronc cérébral, a été rapidement retiré. Les membranes synaptosomiques ont été préparées à partir du cerveau par centrifugations et centrifugation par gradient après leur homogénéisation. Les protéines synaptosomiques ainsi obtenues ont été utilisées dans le test de liaison. L’OC2 Des tests de liaison aux récepteurs ont été effectués avec des cellules transfectées. Les cellules COS-7 ont été transfectées avec des plasmides contenant du CB2 ADNc récepteur et membranes brutes ont été préparés. La haute affinité CB1/CB2 ligand récepteur, [3H]-HU-243, avec une constante de dissociation de 45 pM, a été incubé avec des membranes synaptosomiques (3 – 4 μg), pour CB1 dosages, ou cellules transfectées, pour CB2 dosages, pendant 90 min à 30°C avec les différents dérivés du cannabidiol ou avec le véhicule seul, puis centrifugé à 13 000 tr/min pendant 6 min. Le radioligand lié et le radioligand libre ont été séparés par centrifugation. Les données ont été normalisées à 100% de la liaison spécifique, qui a été déterminée avec 50 nM non étiquetés HU-243. Toutes les expériences ont été répétées 2 à 3 fois et chaque point a été effectué en trois exemplaires. Le KJe Les valeurs ont été déterminées avec un programme GraphPad Prism version 2.01 (San Diego, CA, U.S.A.) et en utilisant l’équation de Cheng – Prusoff.

Dosage de l’absorption cellulaire de l’anandamide

L’effet des composés sur l’absorption de [14C]-AEA par des cellules de leucémie basophile de rat (RBL – 2H3) a été étudié en utilisant 3,6 μM (10 000 c.p.m.) de [14C]-AEA tel que décrit précédemment (Bisogno et coll., 1997). Les cellules ont été incubées avec [14C]-AEA pendant 5 min à 37°C, en présence ou en l’absence de concentrations variables des inhibiteurs. Résiduel [14C]-AEA dans le milieu d’incubation après extraction avec CHCl3/CH3OH2 : 1 (en vol.), déterminé par comptage par scintillation de la phase organique lyophilisée, a été utilisé comme mesure de l’AEA absorbé par les cellules (de petrocellis et al., 2000). Les données sont exprimées sous forme de concentration exerçant une inhibition de 50 % de l’absorption de l’AEA (IC50) calculé par GraphPad.

Dosage de l’hydrolase amide d’acide gras

L’effet du CBD et de ses analogues sur l’hydrolyse enzymatique de l’AEA a été étudié comme décrit précédemment (Bisogno et coll., 1997), en utilisant des membranes cellulaires de cellules de neuroblastome de souris (N18TG2), incubées avec des composés et [14C]-AEA (9 μM) dans 50 m Tris-HCl, pH 9, pendant 30 min à 37°C. [14C]-éthanolamine produite à partir de [14L’hydrolyse C]-AEA a été mesurée par comptage par scintillation de la phase aqueuse après extraction du mélange d’incubation avec 2 volumes de CHCl3/CH3OH 2 : 1 (par vol.). Les données sont exprimées sous forme de concentration exerçant une inhibition de 50 % de l’absorption de l’AEA (IC50), calculé par GraphPad.

Statistiques

Les moyennes ont été comparées au moyen d’une analyse de variance suivie du test de Bonferroni (ANOVA, logiciel StatMost™, DataMost Corp.).

Résultats

Effet des analogues du CBD sur les récepteurs VR1 vanilloïdes humains

Les effets sur [Ca2+]Je dans les cellules HEK – hVR1 de CBD, (+)-CBD et (−)-7-hydroxy-5′-DMH-CBD (HU-317) sont illustrées à la figure 2. Ces trois composés ont tous induit une augmentation de [Ca2+]Je et se comportaient comme des agonistes complets par rapport à la capsaïcine, bien que seuls les deux premiers composés aient exercé cet effet avec une CE50<10 μM et indépendamment de leur stéréochimie. En fait, la puissance (CE50 3,2±0,4) et l’efficacité (effet max. 68,5±3,1% de l’effet de 4 μM ionomycine) du (+)-CBD étaient indiscernables de celles du CBD (EC50 3,5±0,3, effet max. 64,1±3,9%, moyenne±s.e.moyenne, n = 4). L’efficacité des deux composés était presque identique à celle d’une concentration maximale de capsaïcine (70,2±3,5% à 10 μM, moyenne±s.e.moyenne, n = 4), qui était cependant 100 fois plus puissante (EC50=26±9 nM). Les six autres analogues du CBD examinés dans cette étude étaient tous inactifs ou très faiblement actifs sur [Ca2+]Je. L’effet du CBD a été aboli par la capsazépine, antagoniste des récepteurs VR1 (10 μM, Figure 2) et n’a pas pu être observé dans les cellules HEK de type sauvage (données non présentées). Cela suggère fortement que cet effet, comme celui de la capsaïcine, était dû à la stimulation des récepteurs VR1. Dosages contraignants pour le déplacement de [3H]-résinifératoxine des membranes cellulaires HEK – hVR1 par CBD et (+)-CBD a confirmé cette hypothèse et a montré que le CBD et le (+)-CBD sont en concurrence pour la liaison de [3H]-résinifératoxine avec KJe valeurs (3,6±0,2 et 3,0±0,3 μM, respectivement, moyennes±s.d., n=3) similaires à la CE50 valeurs de l’effet sur [Ca2+]Je. De plus, la capsaïcine (0,1 μM) et le CBD (10 μM) présentaient une désensibilisation croisée de leur effet sur [Ca]2+]Je, fournissant des preuves compatibles avec ces deux composés agissant sur le même récepteur. Une pré-exposition de 1 h à 0,1 μ deM de capsaïcine a réduit l’effet de 10 μ M CBD de 66,7±3,4 à 11,7±1,5% de l’effet de 4 μ M ionomycine, tandis qu’une pré-exposition de 1 h à 10 μ M CBD a réduit l’effet de 0,1 μ M capsaïcine de 68,1±4,1 à 22,3±3,5% (moyenne±s.e.moyenne, n = 4, P<0,01 par ANOVA). Le cotraitement des cellules avec de la capsaïcine (10 μM) et du CBD (10 μM) n’a produit aucun effet additif (72,2±4,1% de l’effet de l’ionomycine, moyenne±s.e.moyenne, n = 4).

Graphique 2
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Effet du (−)-CBD, du (+)-CBD, du (−)-7-OH-5′-DMH-CBD et de la capsaïcine sur le Ca cytosolique2+ concentration dans les cellules HEK-hVR1. L’effet est exprimé en pourcentage de l’effet de 4 μM ionomycine, et les données représentent les moyennes ± d. de n = 4 expériences. L’effet de la capsazépine (CPZ, 10 μ M) sur le CBD 10 μM est également montré (triangle ouvert).

Affinité des analogues du CBD pour le cannabinoïde CB1 et CB2 Récepteurs

Sur les neuf composés testés, les analogues (−) étaient tous faiblement actifs ou inactifs (KJe>10 μM) dans les dosages de liaison pour le CB1 et CB2 affinité des récepteurs (tableau 1), à l’exception du (−)-7-hydroxy-5′-DMH-CBD, qui présentait une faible affinité pour le CB2 récepteurs (KJe=0,7 μM). En revanche, sur les trois (+)-analogues testés, le (+)-5′-DMH – CBD et le (+)-7-hydroxy-5′-DMH – CBD se sont comportés comme des CB de haute affinité1 ligands récepteurs (KJe= 17,4 et 2,5 nM), et étaient 10 à 20 fois moins actifs que CB2 ligands récepteurs (KJe= 211 et 44,0 nM).

Tableau 1. Les structures chimiques des composés examinés dans cette étude et leur activité sur l’absorption de [14C]-anandamide (AEA) par cellules RBL – 2H3 (AMT, IC50, μM), l’hydrolyse de [14C]-AEA par membranes cellulaires N18TG2 (FAAH, IC50, μM), la liaison de [3H]-HU-243 aux synaptosomes cérébraux de rat (CB1, KJe, μM) et la liaison de [3H]-HU-243 à COS-7 CB2-membranes cellulaires transfectées (CB2, KJe, μM)
image

Effet des analogues du CBD sur le transporteur membranaire de l’anandamide

Sur les neuf analogues testés, seuls le (+)- et (−)-CBD, le (+)- et le (−)-5′-DMH-CBD et le (+)- et (−)-7-hydroxy-5′-DMH – CBD ont inhibé l’absorption de [14C]-AEA à partir de cellules RBL – 2H3 avec IC50 valeurs inférieures à 25 μM (figure 3 et tableau 1). Parmi ces six composés, les énantiomères (+) étaient significativement (P<0,05 par ANOVA) et systématiquement plus actifs que les énantiomères (−), et, en particulier, le (+)-5′-DMH-CBD et le (+)-7-hydroxy-5′-DMH-CBD étaient aussi puissants que l’inhibiteur de l’AMT, AM404 (Khanolkar & Makriyannis, 1999) (IC50= 10,0, 7,0 et 8,1 μM pour les deux composés et AM404, respectivement). Le (−)-7-hydroxy-5′-DMH-CBD et le (−)-5′-DMH-CBD étaient également presque aussi puissants que l’AM404 (IC50= 12,5 et 14,0 μM). Le CI50 de CBD (22,0 μ M) était plus élevé que celui précédemment rapporté pour ce composé dans la même lignée cellulaire (11,4 μM; Rakhshan et coll., 2000).

Graphique 3
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Effet du (−)-CBD et de certains de ses analogues sur l’absorption de [14C]-anandamide (AEA) par RBL – cellules 2H3. L’effet est exprimé en pourcentage de [14C]-AEA absorbé par les cellules en l’absence de toute substance, et les données sont des moyens d’expériences n = 4. Les barres s.e.m. ne sont pas indiquées par souci de clarté et n’ont jamais été supérieures à 5% des moyennes.

Effet des analogues du CBD sur l’hydrolase des amides d’acides gras

Seuls le (+)- et (−)-CBD, et le (−)-7-hydroxy-CBD présentaient un CI50<100 μM pour l’inhibition de [14Hydrolyse C]-AEA par des préparations membranaires cellulaires N18TG2 (Figure 4 et Tableau 1), qui expriment des niveaux élevés de FAAH. L’énantiomère (−) était significativement plus puissant que l’énantiomère (+), le CBD étant également le composé le plus puissant trouvé (IC50=27,5 μM). Cependant, aucun des analogues du CBD testés ne peut être considéré comme un inhibiteur puissant de la FAAH (c’est-à-dire avec un CI5020 μM). L’activité du CBD dans cette étude était plus élevée que celle précédemment signalée pour l’hydrolyse de l’anandamide par le cerveau de souris (Watanabe et coll., 1996; 1998), où seule une très forte concentration du composé (160 μM) a toutefois été utilisée.

Graphique 4
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Effet du cannabidiol (CBD) et de certains de ses analogues sur l’hydrolyse de [14C]-anandamide (AEA) par les membranes cellulaires N18TG2. L’effet est exprimé en pourcentage de [14C]-AEA hydrolysé en l’absence de toute substance, et les données sont des moyennes±s.e.moyenne de n = 4 expériences. •=(+)-CBD; ○=CBD; ▴=(−)-7-hydroxy-CBD.

Discussion

Dans cette étude, nous avons cherché à savoir si le CBD, maintenant considéré comme un agent thérapeutique possible (Straus, 2000), est capable d’interagir avec le récepteur vanilloïde VR1 récemment cloné. En fait, certaines des actions pharmacologiques du CBD sont similaires à celles des agonistes naturels (par exemple la capsaïcine) et synthétiques de VR1. Bien que la stimulation des récepteurs VR1 entraîne une vasodilatation et une inflammation, la capsaïcine et ses analogues à longue chaîne exercent des effets anti-inflammatoires en désensibilisant rapidement les récepteurs VR1 à l’action des stimuli nociceptifs et en provoquant l’épuisement des neuropeptides vasoactifs sensoriels (Szallasi & Blumberg, 1999). Le CBD induit également des effets anti-inflammatoires, une explication possible de cette propriété étant sa capacité à moduler la libération de médiateurs anti-inflammatoires ou pro-inflammatoires (Srivastava et al., 1998, Malfait et al., 2000). Le CBD et la capsaïcine ont également en commun des effets anticonvulsifs et anti-polyarthrite rhumatoïde (Consroe et coll., 1981; Dib et Falchi, 1996; Malfait et coll., 2000; Lorton et coll., 2000). Ici, nous avons constaté que le CBD, comparé à la capsaïcine, est un agoniste complet, bien que faible, de VR1 humain à des concentrations qui pourraient être atteintes après l’administration de ce composé aux doses souvent utilisées in vivo (10 – 50 mg kg−1 chez les hommes), et inférieur à ceux requis pour que le CBD se lie aux récepteurs cannabinoïdes. Le CBD a désensibilisé VR1 à l’action de la capsaïcine, ouvrant ainsi la possibilité que ce cannabinoïde exerce une action anti-inflammatoire en partie par désensibilisation des nocicepteurs sensoriels. Études futures sur la capsazépine (qui antagonise les effets de la capsaïcine chez le rat (Di Marzo et coll., 2001), mais pas toujours chez la souris (Di Marzo et coll., 2000b) et les souris « knock-out » VR1 (Davis et coll., 2000; Caterina et al., 2000), devrait tester l’implication de VR1 dans les actions pharmacologiques du CBD.

Nous avons constaté que l’insertion dans le CBD d’un DMH au lieu d’une chaîne n-pentyle sur le C-5′, ou d’une fonction carboxyle au lieu du groupe méthyle sur le C-1, abolit la capacité du cannabinoïde à induire une réponse fonctionnelle médiée par VR1, tandis que l’insertion à la fois d’un groupe hydroxy sur le C-7 et d’un groupe 5′-DMH diminue la puissance mais pas l’efficacité du CBD. En revanche, l’inversion de la stéréochimie ne modifie pas l’activité du CBD. Ces données suggèrent que le méthyle C-1 et le cycle aromatique « A », qui est chimiquement similaire à la fraction vanillyle de la capsaïcine (Figure 1), sont plus importants que la partie chirale du CBD pour son interaction avec VR1. Le fait que le CBD se lie au même site que la capsaïcine est suggéré par la découverte que les deux composés se déplacent [3H]-résinifératoxine provenant de ses sites de liaison spécifiques dans les membranes des cellules surexprimant les récepteurs VR1 (cette étude et Ross et coll., 2001). Cependant, alors que la capsaïcine présente une puissance plus élevée que l’affinité pour les récepteurs vanilloïdes (Szallasi & Blumberg, 1999), le CBD est aussi actif dans le [3Essai de liaison à la H]-résinifératoxine comme dans le test fonctionnel hVR1. Cela suggère que le CBD est moins capable que la capsaïcine d’induire une réponse fonctionnelle médiée par VR1 à de faibles concentrations, même si l’efficacité de concentrations élevées des deux composés est la même. Il convient de noter que les cellules utilisées ici pour évaluer l’activité fonctionnelle à VR1 expriment des niveaux élevés de ce récepteur, et que la puissance et l’efficacité du CBD dans les cellules natives contenant des quantités plus faibles de récepteurs vanilloïdes pourraient être inférieures à celles observées ici.

On pense que l’endocannabinoïde AEA exerce des actions anti-inflammatoires et neuroprotectrices (Di Marzo et al., 2000a; Hansen et coll., 1998). Comme on a constaté qu’il inhibait la recapture et l’hydrolyse de l’AEA in vitro (Rakhshan et coll., 2000; Watanabe et al., 1996), il est possible que le CBD agisse en partie en interférant avec l’inactivation de l’AEA, améliorant ainsi l’action inhibitrice tonique présumée de l’AEA sur l’inflammation. Le fait que les actions pharmacologiques du CBD ne sont pas influencées par le CB1/CB2 les antagonistes des récepteurs ne devraient pas être considérés comme une preuve contre cette hypothèse, puisqu’il est maintenant établi que l’AEA agit également sur les cibles des récepteurs non cannabinoïdes, y compris les récepteurs VR1 et les canaux TASK-1 K (Zygmunt et coll., 1999; Maingret et coll., 2001). Ici, nous avons confirmé que le CBD inhibe l’absorption médiée par les transporteurs d’AEA par les cellules et l’hydrolyse enzymatique. Nous avons également constaté que les analogues du CBD sont des inhibiteurs de l’AMT, et que cette propriété est plus prononcée avec les énantiomères (+), ou lorsque les C-7 et C-5′ sont dérivatisés avec un groupe hydroxyle et DMH, respectivement. L’inhibiteur le plus puissant trouvé était le (+)-7-hydroxy-5′-DMH-CBD. Cependant, ce composé présentait une forte affinité pour le CB+1 et CB2 Récepteurs. Aussi (+)-5′-DMH-CBD était plus actif en tant que CB1 et CB2 ligand récepteur que comme inhibiteur de l’AMT. En revanche, le (−)-7-hydroxy-5′-DMH-CBD et le (−)-5′-DMH-CBD, qui étaient presque aussi puissants que l’AM404 contre l’AMT, mais, contrairement à AM404, avaient une faible affinité pour les deux sous-types de récepteurs cannabinoïdes et aucune activité à VR1, peuvent représenter des outils pharmacologiques métaboliquement stables et relativement sélectifs pour l’étude de l’inactivation de l’AEA in vitro. Le (−)-5′DMH-CBD est obtenu par une synthèse facile à haut rendement (Baek et al., 1985) et peut trouver une application comme agent thérapeutique pour les troubles où l’AEA exerce un tonus endogène avec des effets bénéfiques. Les nouveaux inhibiteurs de l’AMT développés ici devraient également être testés sur l’absorption cellulaire du palmitoyléthanolamide, un congénère anti-inflammatoire naturel de l’AEA (Lambert & Di Marzo, 1999), car une étude récente a montré que le CBD inhibe le transport facilité de ce composé dans les cellules RBL – 2H3 (Jacobsson & Fowler, 2001).

Nous avons mentionné ci-dessus que les énantiomères (+) des analogues du CBD testés ici sur l’absorption cellulaire AEA étaient des inhibiteurs plus puissants que les énantiomères (-). Une certaine spécificité énantio pour l’interaction avec l’AMT a été notée précédemment également pour les analogues de l’AEA (voir Khanolkar & Makriyannis, 1999, pour examen). Il a également été noté que la même préférence stéréochimique existait pour l’interaction de ces composés avec les FAAH, alors que l’interaction avec le CB1 les récepteurs suivaient l’énantio-sélectivité opposée (Khanolkar & Makriyannis, 1999). Nous avons noté que le CBD inhibe la FAAH plus puissamment que l’énantiomère (+). En revanche, tous les analogues (+)-CBD testés sauf un présentaient une affinité beaucoup plus élevée pour le CB.1 que leurs (−)-énantiomères. Ainsi, pour les analogues du CBD, les exigences stéréochimiques pour l’interaction avec l’AMT et le CB1 Les récepteurs sont les mêmes, et ils peuvent être opposés à ceux nécessaires à l’interaction avec la FAAH. Les données contraignantes étaient en effet inattendues. Dans la série tétrahydrocannabinol, les énantiomères (−) (3 R,4R) se lient au CB1 et ont une activité pharmacologique dans divers essais typiques de cannabinoïdes, tandis que les énantiomères (+) (3 S,4S) sont essentiellement inactifs (Mechoulam et coll., 1988; Howlett et coll., 1990; Little et coll., 1989; Jarbe et coll., 1989). Dans la série de composés CBD, nous avons observé ici la situation inverse. La raison de cette dichotomie est inconnue. Autres études sur la puissance et l’efficacité des composés dans les essais fonctionnels de CB1 une activité médiée par les récepteurs doit être réalisée afin d’évaluer pleinement l’activité cannabimimétique des composés de la série (+)-CBD.

En conclusion, la présente étude a fourni de nouvelles informations sur le(s) mécanisme(s) d’action possible(s) du cannabinoïde naturel CBD en identifiant dans les récepteurs VR1 une nouvelle cible moléculaire potentielle pour ce composé. De plus, nous avons montré que de puissants inhibiteurs de l’absorption cellulaire de l’AEA peuvent être développés à partir de certaines modifications chimiques du CBD, et nous avons confirmé que le CBD peut également agir en principe en inhibant l’inactivation de l’AEA. Des études futures seront nécessaires pour répondre à la question de savoir si les récepteurs vanilloïdes ou les cannabinoïdes endogènes contribuent aux actions anti-inflammatoires et neuroprotectrices du CBD.

Remerciements

Nous remercions le National Institute on Drug Abuse des États-Unis (subvention DA 9789, à R. Mechoulam), la Fondation israélienne des sciences (à R. Mechoulan), l’Association Yeshaya Horowitz (à R. Mechoulam) et le MURST (3933 à V. Di Marzo) pour leur soutien.

 

Détails de l'étude :
Cibles moléculaires pour le cannabidiol et ses analogues synthétiques: effet sur les récepteurs vanilloïdes VR1 et sur l’absorption cellulaire et l’hydrolyse enzymatique de l’anandamide - Bisogno - 2001 - British Journal of Pharmacology - Wiley Online Library

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02 janvier, 2023 — Benoit Redis
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